1、抗体选择

抗体是ADC实现靶向输送的基础，因此对于抗体的选择是ADC的关键之一。对于抗体的筛选主要考虑以下几个方面：

（1）抗体所识别抗原为肿瘤特异性抗原，在肿瘤细胞表面高表达，在正常细胞内不表达或极少表达，这是特异性识别的重要条件。（2）抗体所识别抗原必须表达于肿瘤细胞表面，不能表达于内部。（3）抗体与抗原识别后，能够迅速的内吞，不能内吞不利于ADC药物的设计（靶向肿瘤细胞外环境的ADC除外）。（4）抗体经过药物小分子和连接子修饰后，不影响抗体的识别活性

2、连接子选择

ADC开发过程中最大挑战之一是为抗体和药物偶联提供适当的连接子。连接子对于ADC药物临床前、临床疗效和安全性都至关重要。理想的连接子在循环系统中必须要有足够的稳定性，因为小分子毒素在循环系统中提前释放可产生非靶向和非预期的毒性。连接子在ADC药物被内化并运输至特定胞内小体后，又必须能够在靶细胞的胞质中将细胞毒素以高活性形式有效地释放。在设计连接子时有多种重要事项需要被考虑，包括抗体的连接位点及内化情况，毒素的性质，连接子的极性等。目前已上市和正处于临床试验阶段的ADC连接子主要分为两大类：不可裂解型连接子和可裂解型连接子。

2.1 不可裂解连接子

不可裂解连接子在血液循环中高度稳定，细胞毒素有效释放主要是通过抗体在溶酶体中降解而释放出带电荷氨基酸的细胞毒素发挥肿瘤杀伤作用。因此，使用不可裂解连接子设计ADC分子时，应要求细胞毒素形成的带电荷氨基酸的代谢产物也具有很强的毒性。如Kadcyla使用不可裂解连接子，其在溶酶体中抗体降解后释放的Lys-MCC-DM1具有很强的抗肿瘤活性。

然而，不可裂解连接子的ADC也存在一些缺点，此类ADC往往更依赖于靶细胞的生物学特征，需要良好的内化过程才能在细胞内发生降解而激活。另外，由于氨基酸残基、连接子和小分子细胞毒素组成的复合物具有较好的亲水性，透膜性会大大降低，因此旁观者效应也会降低。

2.2 可裂解连接子

目前，已上市的及在研的大多数ADC药物使用可裂解连接子，这类连接子利用肿瘤微环境区别于正常细胞的某些特性裂解释放出细胞毒素杀伤肿瘤，要求血液循环中稳定性高，而在靶部位能够快速释放出细胞毒素发挥作用。主流的可裂解连接子包括酸不稳定的腙类连接子、谷胱甘肽敏感连接子和蛋白酶水解连接子。

2.2.1 酸不稳定的腙类连接子

对酸不稳定的腙类连接子是早期第一类被用于构建ADC的连接子。该类连接子在血液循环中性pH环境中保持稳定（pH=7.3-7.5），而当ADC被肿瘤细胞内吞进入到内涵体（pH=5.0-6.5）和溶酶体（pH=4.5-5.0）酸性环境后，可立即发生水解反应释放出细胞毒素，目前已被FDA批准上市的Mylotarg和Besponsa均是该类连接子的ADC。虽然多项临床研究表明这种pH依赖的腙类连接子存在非特异性释药的缺点，可产生明显的毒副作用，但这种技术目前依然在使用，另外，也可通过化学修饰手段来增加腙类连接子的稳定性和体内半衰期，以尽可能地减少药物在循环系统中的损伤，在降低副作用的同时获得更有效的治疗效果。

2.2.2 谷胱甘肽敏感连接子

二硫化物连接子中的二硫键可被谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）等胞质内巯基辅助因子切断。通常细胞内还原型GSH的浓度较高，介于0.5-10mM之间，尤其在肿瘤组织中，由于其血管分布不规则导致的缺氧环境可使还原酶活性提高，从而进一步提升GSH的浓度。相反，在人体血液循环中，GSH和Cys的浓度则非常低，约为5uM。这种上千倍的浓度差异可使ADC实现选择性释药过程，在人体血液循环中保持较稳定的存在，而被内化到肿瘤细胞的强还原性环境后立即释放细胞毒素。但二硫键连接子在亲电、亲核极性溶剂中均不稳定，增加其位阻可以部分改善血液循环中的稳定性，但这类连接子在ADC药物中应用很少，正逐步退出ADC药物的舞台。

2.2.3 蛋白酶水解连接子

比较常见的酶水解型连接子包括利用组织蛋白酶切割的连接子以及基于β-葡萄糖醛酸苷酶切割的连接子，其中组织蛋白酶切割的连接子已被广泛应用在许多已上市的ADC药物中。

组织蛋白酶B是一种Cys蛋白酶，通常在哺乳动物细胞溶酶体中高表达，同时，该蛋白酶也与肿瘤进展有关，可以在多种肿瘤细胞中观察到其过表达。组织蛋白酶B可以对特定序列的二肽进行酶切，从而为二肽连接子在细胞内被选择性裂解提供了机会。

在早期连接子的研究中发现，如果将二肽类片段直接与细胞毒素相连，酶裂解后释放出的毒素药物形式往往含有氨基酸的加合物，这使得一些细胞毒素的毒性降低，无法发挥出原有的杀伤效果。因此，引入PAB这样一种自切除式间隔基，将药物和二肽类连接子的酶裂解位点隔开以避免上述现象产生的不利影响。PAB的氨基端可与肽连接形成酰胺键，苄基端可与毒素分子中的胺通过对氨基苄氧羰基（PABC）相连。一旦ADC内化进入溶酶体被组织蛋白酶B切割后，PABC会立即发生1,6-消除反应，释放除未经修饰的细胞毒素，二氧化碳及连接基团的残余结构。利用该原理开发的二肽类连接子缬氨酸-瓜氨酸-PABC（Val-Cit-PABC）和缬氨酸-丙氨酸-PABC（Val-Ala-PABC），特别是Val-Cit-PABC现已广泛用于ADC药物的偶联，已上市的14款ADC药物（不含2022年退市的Blenrep）中，有7款是使用了该连接子。

荣昌生物维迪西妥单抗示意图

β-葡萄糖醛酸苷酶是溶酶体内糖苷酶类的酸性水解酶，可催化多糖中β-葡萄糖醛酸残基的分解。该酶同组织蛋白酶一样，在细胞外的活性很低，而在溶酶体中大量存在，并且在一些肿瘤类型中过表达，针对该酶开发出的β-葡萄糖醛酸连接子，其释放方式与二肽类连接子相似，在溶酶体内经过β-葡萄糖醛酸苷酶酶切后，间隔子PABC会立即发生1,6-消除从而完成小分子细胞毒素的释放。

3、细胞毒素选择

目前上市及临床上应用较为成熟的细胞毒素包括：（1）微管抑制剂，如Auristadin类细胞毒素MMAE、MMAF，目前已上市的Adcetris、Polivy等6款ADC药物使用这类细胞毒素；美登素类细胞毒素DM1、DM4等，如上市的Kadcyla。（2）DNA烷化剂，如PBD dimer；（3）DNA损伤剂，如卡奇霉素，目前已成功应用于上市药物Mylotarg 和Besponsa中。（4）拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱衍似物SN38，DXd等。

除上述传统的细胞毒素外，2020年9月上市的Akalux则使用染料IR700为载体，偶联到抗体上形成抗体-IR700为复合物，该复合物大量结合在肿瘤细胞上，在近红外光照射下，IR700产生化学变化，吸收光能并发热，使肿瘤细胞急速膨胀、破坏并坏死，肿瘤细胞内的物质释放至胞外，被邻近免疫系统识别而迅速消除。此外，免疫刺激剂（TLR7/8、STING）、放射剂（Thorium-227）等也在临床应用中崭露头角，使抗肿瘤毒素呈现多样化。